技術原理
晚期凋亡細胞中染色體DNA雙鏈或單鏈斷裂產生粘性3'-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的催化下，將帶有熒光素分子的dUTP標記到DNA的3'-末端，然后通過熒光顯微鏡觀察、或進而用帶有HRP的一抗染色后DAB顯色，可以進行凋亡細胞的檢測，該實驗稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。
Tunel檢測可以標記組織細胞中發(fā)生凋亡的細胞，通過核復染計數細胞比例，可以計算一定組織細胞中發(fā)生凋亡的細胞比例，常用在各方向生物學研究中凋亡發(fā)生的檢測以及定性比較。
實驗流程
石蠟切片/冰凍切片/細胞爬片-脫蠟-通透-酶標記反應-HRP抗體,DAB顯色，可白光拍照-核復染-觀察拍照。
實驗方法
對于貼壁細胞或細胞涂片
a. PBS或HBSS洗滌一次。
b. 如果細胞貼得不牢，可以干燥樣品使細胞貼得更牢。
c. 用4%多聚甲醛或碧云天生產的免疫染色固定液(P0098)固定細胞30-60分鐘。
d. 用PBS或HBSS洗滌一次。
e. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分鐘。
f. 轉步驟5。
對于懸浮細胞或細胞懸液
a. 收集細胞(不超過200萬細胞)，PBS或HBSS洗滌一次。
b. 用4%多聚甲醛固定細胞30-60分鐘。為防止細胞聚集成團，宜在側擺搖床或水
平搖床上緩慢搖動的同時進行固定。
c. 用PBS或HBSS洗滌一次。
d. 用含0.1% Triton X-100的PBS重懸細胞，冰浴孵育2分鐘。
e. 轉步驟5。
對于石蠟切片
a. 二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘。90%乙醇2分鐘。70%乙醇2分鐘，蒸餾水2分鐘。
b.滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分鐘(不同組織的作用溫度和時間需自行摸索)。
c. PBS或HBSS洗滌3次。注意：這一步必須把蛋白酶K洗滌干凈，否則會嚴重干擾后續(xù)的標記反應。
d. 轉步驟5。
對于冷凍切片
a. 用4%多聚甲醛固定細胞30-60分鐘。
b. PBS或HBSS洗滌2次，每次10分鐘。
c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分鐘。
d. 轉步驟5。
對于貼壁細胞、細胞涂片或組織切片
a. 用PBS或HBSS洗滌2次。
b. 在樣品上加50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育60分鐘。注意：孵育時需注意在周圍用浸足水的紙或藥棉等保持濕潤，以盡量減少TUNEL檢測液的蒸發(fā)。
c. PBS或HBSS洗滌3次。
d. 用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發(fā)波長范圍為450-500nm，發(fā)射波長范圍為515-565nm(綠色熒光)。
對于懸浮細胞或細胞懸液
a. 用PBS或HBSS洗滌2次。
b. 加入50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育60分鐘。
c. PBS或HBSS洗滌2次。
d. 用250-500μl PBS或HBSS懸浮。
e. 此時可以用流式細胞儀進行檢測或涂片后在熒光顯微鏡下觀察?？梢允褂玫募ぐl(fā)波長范圍為450-500nm，發(fā)射波長范
圍為515-565nm(綠色熒光)。
樣本保存運輸
實驗項目 | 標本要求 | 標本保存運輸條件 | 可能存在風險 | 建議 |
Tunel檢測 | 按制作石蠟切片、冰凍切片、細胞爬片要求送樣 | 石蠟切片常溫、冰凍切片-20℃、固定后細胞爬片 | 染色結果同造模效果密切相關，正常組織可能陽性率很低 | 以實際結果為準 |
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